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過去二十幾年里，隨著基因測序技術水平的提高以及千人基因組計劃、癌癥基因組計劃、Meta-Hit計劃等重大國際合作項目的相繼開展，基因組研究日漸被推向高潮。然而，迄今為止使用的測序材料無一例外都是數百萬甚至更多細胞的混合DNA樣本。這種方法能夠得到全基因組序列信息，但是對其進行研究得到的結果只是一群細胞中信號的平均值，或者只代表其中占優勢數量的細胞信息，單個細胞獨有的特性被忽視。例如，科學家想找出哪種突變存在于哪種細胞中幾乎是不可能的，只存在于少數細胞（如早期癌細胞）中的突變也基本上被掩藏。另一方面，有些樣品稀少無法在實驗室培養，樣品量不足以進行全基因組分析，例如腫瘤循環細胞、組織微陣列、早期發育的胚胎細胞等。這些都是全基因組測序遇到的難題。
作為“在單個細胞水平上對基因組進行測序”的單細胞測序技術能夠解決上述難題。與傳統的全基因組測序相比，單細胞測序不僅測量基因表達水平更加精確，而且還能檢測到微量的基因表達子或罕見非編碼RNA，其優勢是全方位和多層次的。
2011年，《自然方法》雜志( Nature Methods )將單細胞測序列為年度值得期待的技術之一[1]，2013年，《科學》雜志（Science）將單細胞測序列為年度最值得關注的六大領域榜首[2]。與此同時，測序巨頭相繼推出新一代測序儀，為單細胞測序提供利器，越來越多與單細胞測序有關的研究也發表在頂級期刊上，這些都表明，單細胞測序已逐漸成為科研熱點，有望成為2013年最值得關注的測序技術。
近年來，流式細胞分選和激光捕獲顯微切割技術的出現讓單細胞的捕獲成為可能。單細胞測序技術正逐漸從實驗研究方法成為指導臨床的有利工具，為基礎研究向臨床轉化搭建了橋梁。單細胞測序主要涉及單細胞基因組測序和轉錄組測序兩方面，分別針對單個細胞的DNA和RNA進行序列分析和比較，進而揭示基因組和轉錄組的變化。
2.1、單細胞全基因組測序
單細胞全基因組測序技術是在單細胞水平對全基因組進行擴增與測序的一項新技術。其原理是將分離的單個細胞的微量全基因組DNA進行擴增，獲得高覆蓋率的完整的基因組之后通過外顯子捕獲進而高通量測序用于揭示細胞群體差異和細胞進化關系。
全基因組擴增技術主要分為兩種類型：一是基于熱循環以PCR為基礎的擴增技術，如簡并寡核苷酸引物PCR (DOP-PCR)、連接反應介導的PCR (LM-PCR)、擴增前引物延伸反應 (PEP)等；一是基于等溫反應不以PCR為基礎的擴增技術，如多重置換擴增 (MDA) 和基于引物酶的全基因組擴增 (pWGA)。
在這兩種類型中，PCR擴增比較經典，但是，對不同的序列來說，PCR擴增的效率存在相當大的偏差，易產生擴增偏倚問題： 如富含CG的DNA序列和相應基因座位的非隨機丟失，等位基因的非隨機丟失，以及與DNA片段大小相關的偏差（傾向于擴增更多短片段），尤其是在應用于單細胞時，大量短片段導致片段間序列丟失，從而使其應用受限。
MDA是目前公認的最好的單細胞基因組擴增技術，它能對全基因組進行高保真的均勻擴增，擴增出10~100kb大小的片段，能提供大量均一完整的全基因組序列。但是MDA也有一些缺點，特別是顯著的非特異擴增，往往空白對照樣品也總是“無中生有”地產生大量的DNA，另外就是仍然存在序列偏差。盡管各種改進的策略正在逐步減少這些缺陷，高覆蓋率、高保真性及高特異性的擴增仍然是亟待解決的問題。另外，對測序得到 的大量數據結果的專業分析也是一個重大的挑戰。 單細胞全基因組測序正在從基礎研究走向臨床應用。
2.2、單細胞轉錄組測序
單細胞轉錄組分析主要用于在全基因組范圍內挖掘基因調節網絡，尤其適用于存在高度異質性的干細胞及胚胎發育早期的細胞群體。與活細胞成像系統相結合，單細胞轉錄組分析更有助于深入理解細胞分化、細胞重編程及轉分化等過程及相關的基因調節網絡。將此技術應用于臨床，理論上可以在生理 或病理情況下連續追蹤基因表達的動力學變化，從而監測疾病的進展。單細胞轉錄組分析的另一應用領域是發現亞細胞成分的基因表達譜，例如對在神經元的軸突或樹突部分特異表達的基因的轉錄組的分析，這些基因往往對細胞的生物學功能發揮著重要作用。但是，鑒于目前的技術手段，單細胞轉錄組測序仍然存在覆蓋率低的弊端，導致除mRNA以 外的長非編碼RNAs難以檢測，并且不能區分正義鏈與反義鏈。最近發展的單分子測序技術無需逆轉錄和擴增步驟而直接對單個細胞的全長mRNAs進 行測序，從而準確地檢測基因不同的剪切亞型的表達水平。隨著技術的發展這些局限性會被逐步優化和改進。
3.1、多重退火和成環循環擴增技術（Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles, MALBAC）
主要研發人：哈佛大學終身教授、美國科學院院士謝曉亮（Sunney Xie）教授
技術看點：降低PCR擴增偏倚，使得單細胞中93%的基因組能夠被測序。這種方法使得檢測單細胞中較小的DNA序列變異變得更容易，因此能夠發現個別細胞之間的遺傳差異。這樣的差異可以幫助解釋癌癥惡化的機制，生殖細胞形成機制，甚至是個別神經元的差異機制。
技術簡介：
PCR擴增具有偏好型而且基因組具有大量的冗余，造成了基因組測序準確性不高。
謝曉亮研發的MALBAC技術能從一個細胞的基因組中，分離出來自單細胞的DNA，然后添加稱作引物的短DNA分子。這些引物可與DNA的隨意部分互補，從而使得它們能夠附著到DNA鏈上，充當DNA復制起點。
這些引物由兩個部分構成——一個包含8個核苷酸的粘性部分變化多樣，可與DNA結合，再加上一個包含27個核苷酸的共同序列。這一共同序列可防止DNA太多次拷貝，大大地降低了擴增偏倚。通過將自身摻入到新拷貝鏈，從而自身成環，防止了過度拷貝。利用這種方法，進行與加入的引物的DNA復制時，可以完成高達93%的基因組測序。
技術論文：Genome-Wide Detection of Single-Nucleotide and Copy-Number Variations of a Single Human Cell
3.2、基于芯片實驗室技術的單細胞測序
主要研發人：斯坦福大學Stephen Quake
技術看點：基于lab on a chip開發
技術簡介：
本技術設計了一種路線，用液體載運細胞通過一連串顯微管道和微閥門，當細胞挨個進入各自的小空位時，它們的DNA就會被提取出來，經過復制用于進一步分析。
此外，本技術不僅能分離細胞，還能用化學試劑將細胞混合起來，通過檢測反應過程中的熒光發射獲得它們的基因編碼。所有這些都能在芯片上完成，不僅操作簡單，而且成本效益高。
Stephen Quake已利用此技術完成了第一例人類單細胞測序，現在他正利用這項技術研究精子細胞中的重組并分析突變率。
技術論文：Genome-wide Single-Cell Analysis of Recombination Activity and De Novo Mutation Rates in Human Sperm
3.3、基于MDA的單細胞測序
主要研發人：深圳華大基因研究院
技術看點：將多重置換擴增(MDA)和測序技術相結合。
技術簡介：
本技術基于多重置換擴增(MDA)，并對該方法的擴增均一性、靈敏度、特異性等方面進行了全面評估。這種將多重置換擴增和測序技術相結合的單細胞測序方法不僅具有更高的分辨率和基因組覆蓋度，而且具有更好的敏感性和特異性。該方法從單核苷酸水平上為各種復雜疾病和生物學過程的研究開辟了新思路。
技術論文：Single-Cell Exome Sequencing and Monoclonal Evolution of a JAK2-Negative Myeloproliferative Neoplasm
Single-Cell Exome Sequencing Reveals Single-Nucleotide Mutation Characteristics of a Kidney Tumor
3.4、Strand-seq
主要研發人：加拿大英屬哥倫比亞大學Peter Lansdorp
技術看點：能捕捉DNA一條鏈上的信息，使得研究人員能對親本DNA模板鏈進行單細胞測序，避免單細胞DNA擴增和測序時丟失定向信息。
技術簡介：
在細胞分裂過程中，當雙螺旋解旋后，兩條染色體上的遺傳信息偶然會出現交換，如果這樣的交換水平不斷提高，就標志著出現了DNA損傷和癌癥。傳統的基因組測序，由于在單細胞DNA擴增和測序的時候，會丟失定向信息，難以檢測到基因重排，因此也就檢測不出這一點。
Strand-seq方法能分別對單細胞的雙親DNA模板鏈進行測序，獲得高分辨率的姊妹染色體交換圖譜，檢測到基因重排，從而發現細胞復制過程中，DNA序列的翻轉或交換。
利用Strand-seq方法，研究人員完成了單鏈DNA測序，并發現了首個基因組壓力和不穩定性的痕跡。
技術論文：DNA template strand sequencing of single-cells maps genomic rearrangements at high resolution
單細胞測序解決了用組織樣本測序時或樣本少無法解決的細胞異質性難題，為從單核苷酸水平深入研究癌癥發生、發展機制及其診斷、治療提供了新的研究思路并開辟了新的研究方向。此外，這一新方法還可被廣泛用于其他重要的生物研究領域，如組織器官內細胞基因組的異質性研究、干細胞的異質性研究、生殖細胞的遺傳重組研究、胚胎的植入前遺傳學診斷研究、法醫學少量DNA測序等。
不過，就目前來說，單細胞測序最常見的應用是在癌癥研究上。由于癌細胞中基因組部分被刪除，或者擴增，從而引起關鍵基因的缺失，或者表達過量，干擾正常細胞生長，因此利用這種方法就能分析基因拷貝數目，從而診斷癌癥。以下列出了單細胞測序常應用的領域。
4.1、腫瘤單細胞測序
已有的研究表明，基因或基因組變異是腫瘤發生的根本原因，利用單細胞全基因組測序技術，可以對獲取的腫瘤細胞進行更為精確和深入的分析，發現正常細胞與腫瘤細胞差異，了解癌細胞的基因如何突變，以及腫瘤的來源、腫瘤的生長規律、屬于哪種基因型等，為早期檢測和診斷腫瘤和腫瘤的個體化治療提供指導。另外，腫瘤的異質性是導致腫瘤耐藥性問題的原因。如果 能從單個腫瘤細胞水平對腫瘤單細胞進行測序，并 找出一個腫瘤在單個細胞上的共同結構，揭露出每個腫瘤細胞的突變規律，這將為藥物研究、腫瘤的靶向治療提供基礎。
2008年，美國華盛頓醫學院的Ley等完成了對一位50多歲死于急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia， AML)的患者的基因組測序工作。他們利用高級流式細胞術分離出細胞表面CD13、CD33和CD117陽性，但CD34陰性的腫瘤細胞，并檢測它的遺傳突變。 最終在患者的腫瘤 DNA中僅發現了10個可能與AML有關的遺傳突變， 其中8個很罕見，這也是首次發現的與AML有關的基因。通過單細胞分析技術，測得每個腫瘤樣本細胞擁有9個突變[3]。
2011年，Navin等利用DOP全基因組擴增及DNA測序對單個乳腺癌細胞進行了拷貝數變異的分析，進而推斷出細胞的群體結構和腫瘤的進化過程。但是由于該方法的基因覆蓋率較低，而且不能在單個核苷酸的分辨率上評價單個腫瘤細胞的遺傳學特征，故并不能檢測在腫瘤發展過程中發揮重要作用的單個核苷酸的改變[4]。
2012年，華大基因首次利用以MDA為基礎的單細胞測序技術對原發性血小板增多癥(essential thrombocythemia, ET)病人的單個骨髓細胞進行了測序并分析，篩查出在ET發病和進展中的驅動基因, 從而證實ET為單克隆來源的疾病[5]。同時，也將該方法與經典方法進行比較，從而建立了具有高敏感性、高特異性、假陽性率低等特點的單細胞測序方法，為分析疾病的遺傳學結構特征及克 隆進化過程提供了新的思路。同樣的方法也用于分析單個腎癌細胞的單核苷酸突變特征，從而在更高的分辨能力上為評價基因改變的復雜性提供了更為優化的方法[6]。
4.2、單生殖細胞測序
單細胞DNA擴增技術和高通量測序技術的發明，使得測序單個生殖細胞的基因組成為可能，利用單細胞全基因組測序技術來研究人類的染色體重組規律，具有以往技術無法比擬的優勢。
美國科學院院士、哈佛大學教授謝曉亮課題組與北京大學生物動態光學成像中心（BIOPIC）研究員李瑞強課題組聯合起來，將單細胞測序應用到一個單一的亞洲男性精子的DNA測序，結果發現基因區附近重組率的降低由分子機制所決定，而非自然選擇的結果，證明這種方法能準確識別單個核苷酸的變化。這項工作首次實現了高覆蓋度的單個精子全基因組測序，構建了迄今為止重組定位精度最高的個人遺傳圖譜，這一技術方法在男性不育癥研究和腫瘤早期診斷及個體化治療等生物醫學領域有著廣泛的應用前景[7]。
美國斯坦福大學醫學中心的研究人員借助單細胞測序技術對源自一名男性的91個精子細胞的全部基因組進行了測序，發現許多新的重組熱點和與間接方法發現的相一致的比率。 隨后他更深程度地測序了8個精子足以確定突變率。這將有助于學界更加了解自然發生的個體遺傳突變，對于不孕不育癥的科研具有重要意義[8]。
美國艾伯特愛因斯坦醫學院的統計遺傳學家Auton在2012年冷泉港的基因組生物學會議上報告說，對近200個精子細胞進行的測序，能夠估算出捐精給他們的男子的重組率。該研究工作詳細結果還未發布，Auton僅表示，他們發現每個精子細胞平均有24.5個重組事件，與來自間接實驗的結果相一致。
4.3、微生物單細胞測序
人體內和環境中生存著各種微生物，但大部分微生物不能在實驗室中培養，這阻礙了研究人員對它們的測序和研究。單細胞測序能夠用來深入研究單個細菌細胞的基因組。
來自J. Craig Venter研究所、加利福尼亞大學以及Illumina Cambridge公司的研究人員就嘗試著對加利福尼亞海洋樣本中的單個細菌——SAR324細胞基因組進行了測序。
研究人員使用的單細胞測序方法利用了多次替換擴增、Illumina GAIIx末端配對測序，以及一種新的能夠解決擴增偏向的單細胞裝配算法（EULER+Velvet-SC）。他們在大腸桿菌和金黃色葡萄球菌上驗證可行性后，隨后將研究對象換成SAR324，結果生成了單細胞基因組序列，裝配出430萬個堿基的contig序列，其中含有3811個開放閱讀框，獲得了傳統全基因組研究中缺少的細胞特異的遺傳信息。
盡管還需要進一步研究來弄清SAR324在環境中的作用，但基因組模式表明該細菌是好氧菌，且移動的。結合tRNA、氨基酸和維生素相關基因，研究人員還發現了參與有氧代謝、鞭毛形成及趨化作用的基因。
今后，研究人員計劃使用相似的策略對不同環境中的單個細菌細胞進行測序，從大海深處到醫院病房及人體內。作者認為，這種經濟高效的方法應該有助于微生物分類和進化的探索，且能夠挖掘出一些環境微生物，其基因和通路能夠為生物技術和生物醫學所用[9]。
從2011年到2012年，經過了兩年迅速的技術演進，單細胞測序吸引了眾多研究人員的眼球，但是它還沒有取得質的飛躍，仍然處于不成熟的階段，在技術上和成本上還遠沒有達到大規模應用的地步。
但是，單細胞測序的前景依然是樂觀的。美國馬里蘭州貝塞斯達美國國家人類基因組研究院（National Human Genome Research Institute in Bethesda, Maryland）的遺傳學家Elaine Ostrander說：單細胞基因組測序技術是一種讓人難以置信的新技術，這種技術的應用潛力無法估量，我們可以憑借這種技術輕而易舉的攻克腫瘤難題。
中國華大基因研究院副院長李英睿說：“單細胞測序新方法為遺傳異質性腫瘤的高精度、全面評估提供了一個非常優秀的研究工具。這種新方法和產生的數據為鑒定與腫瘤發展相關的候選基因提供了科學依據，也必將會推動癌癥的遺傳機理和生物學過程更深入的研究。”
我們有理由相信，在不遠的未來，單細胞測序將會把組織器官內細胞基因組的異質性研究、干細胞的異質性研究、生殖細胞的遺傳重組研究、胚胎的植入前遺傳學診斷研究等領域帶入一個前所未有的精致程度，我們將迎來更多革命性的科技進步。
[2]Single-Cell Sequencing Tackles Basic and Biomedical Questions
[3]DNA sequencing of a cytogenetically normal acute myeloid leukaemia genome
[4]Tumour evolution inferred by single-cell sequencing
[5]Single-Cell Exome Sequencing and Monoclonal Evolution of a JAK2-Negative Myeloproliferative Neoplasm
[6]Single-Cell Exome Sequencing Reveals Single-Nucleotide Mutation Characteristics of a Kidney Tumor
[7]Probing Meiotic Recombination and Aneuploidy of Single Sperm Cells by Whole-Genome Sequencing
[8]Genome-wide Single-Cell Analysis of Recombination Activity and De Novo Mutation Rates in Human Sperm
原文來自：http://www.biodiscover.com/topic/technology/254.html
